細(xì)胞因子（如IL-2、TNF-α、IFN-γ等）是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號分子，其活性通常用EC50（半數(shù)最大有效濃度）來評估。EC50是指細(xì)胞因子達(dá)到最大生物學(xué)效應(yīng)一半時所需的濃度，值越小，表明活性越強(qiáng)。

細(xì)胞因子EC50通常使用細(xì)胞增殖檢測、報告基因檢測、流式檢測、ELISA檢測、生物傳感器及其他方法，下面我們一一介紹相關(guān)方法。

●原理

某些細(xì)胞因子（如IL-2、IL-6）能促進(jìn)特定細(xì)胞系的增殖，通過檢測細(xì)胞數(shù)量或代謝活性（如CCK-8、MTT法）來計算EC50。

●實驗步驟

細(xì)胞培養(yǎng)：選擇依賴目標(biāo)細(xì)胞因子的細(xì)胞系（如CTLL-2細(xì)胞依賴IL-2）。

梯度稀釋：將細(xì)胞因子按不同濃度加入培養(yǎng)體系。

檢測增殖：培養(yǎng)48-72小時后，用CCK-8/MTT法測OD值。

計算EC50：用GraphPad Prism等擬合劑量-反應(yīng)曲線。

●優(yōu)缺點

? 優(yōu)點：直接反映生物學(xué)活性，結(jié)果可靠。

? 缺點：耗時長（需細(xì)胞培養(yǎng)），易受細(xì)胞狀態(tài)影響。

●原理

構(gòu)建攜帶報告基因（如熒光素酶、GFP）的工程細(xì)胞系，細(xì)胞因子激活信號通路（如STAT、NF-κB）后誘導(dǎo)報告基因表達(dá)，通過熒光/發(fā)光強(qiáng)度計算EC50。

●實驗步驟

轉(zhuǎn)染細(xì)胞：用含報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如HEK293T-STAT3-luc）。

刺激細(xì)胞：加入不同濃度細(xì)胞因子。

檢測信號：用熒光素酶檢測系統(tǒng)測發(fā)光值。

數(shù)據(jù)分析：擬合曲線計算EC50。

●優(yōu)缺點

? 優(yōu)點：靈敏度高，適合高通量篩選。

? 缺點：需基因工程改造細(xì)胞，可能受非特異性信號干擾。

●原理

某些細(xì)胞因子（如IFN-γ）能誘導(dǎo)細(xì)胞表面標(biāo)志物（如MHC-II）或磷酸化蛋白（如p-STAT1）表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測。

●實驗步驟

刺激細(xì)胞：用不同濃度細(xì)胞因子處理細(xì)胞（如THP-1細(xì)胞+IFN-γ）。

抗體標(biāo)記：用熒光抗體檢測目標(biāo)蛋白（如抗-pSTAT1-PE）。

流式分析：計算MFI（平均熒光強(qiáng)度），擬合EC50。

●優(yōu)缺點

? 優(yōu)點：單細(xì)胞分辨率，可多參數(shù)分析。

? 缺點：設(shè)備昂貴，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜。

●原理

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）可檢測細(xì)胞因子濃度，但需注意：ELISA測的是蛋白含量，不一定代表活性！若要測EC50，需結(jié)合功能實驗。

●實驗步驟

標(biāo)準(zhǔn)曲線：用重組蛋白梯度稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣本檢測：測待測樣本的OD值，計算濃度。

活性驗證：通常需結(jié)合細(xì)胞實驗（如增殖或報告基因）。

●優(yōu)缺點

? 優(yōu)點：操作簡單，適合大批量樣本。

? 缺點：無法區(qū)分活性與非活性形式（如結(jié)合態(tài)vs游離態(tài)）。

●原理

利用表面等離子共振（SPR）、生物層干涉儀（BLI）等技術(shù)，實時監(jiān)測細(xì)胞因子與受體的結(jié)合動力學(xué)，計算EC50。

●實驗步驟（以SPR為例）

固定受體：將細(xì)胞因子受體偶聯(lián)至芯片。

注入樣本：不同濃度細(xì)胞因子流過芯片。

檢測信號：實時監(jiān)測結(jié)合-解離曲線。

計算EC50：擬合結(jié)合動力學(xué)數(shù)據(jù)。

●優(yōu)缺點

? 優(yōu)點：無需標(biāo)記，實時監(jiān)測結(jié)合活性。

? 缺點：設(shè)備昂貴，需優(yōu)化結(jié)合條件。

qPCR：檢測細(xì)胞因子下游基因表達(dá)（如SOCS3），間接反映活性。

細(xì)胞遷移實驗：適用于趨化因子（如IL-8）的EC50測定。

蛋白質(zhì)組學(xué)/磷酸化組學(xué)：全面分析細(xì)胞因子調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)。

選擇合適的檢測方法，才能準(zhǔn)確評估細(xì)胞因子的EC50，為藥物研發(fā)或基礎(chǔ)研究提供可靠數(shù)據(jù)！